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Western blot试验方法

具体实验流程(以细胞为例):

1.        细胞总蛋白的提取

l  预冷的PBS洗细胞2次,弃之,加入细胞裂解液50ul6d培养皿),冰上放20分钟。

l  用细胞刮将细胞刮下,用Tip头吹打几次后将细胞移到预冷的1.5ml EP管中,冰上1小时。

l  410000r/min离心10分钟,将上清移至另一预冷的EP管中,沉淀弃之。

l  Bradford 法测定蛋白含量后,将剩余蛋白样品加入等体积的2×SDS上样缓冲液,沸水中煮5分钟。

l  冷却后分装样品,-70℃保存。

2.        按常规进行SDS-PAGE分离蛋白样品

l  制胶板:根据需要配好分离胶:如12%分离胶10ml

ddH2O                          3.3ml

30%丙烯酰胺                    4.0ml

1.5M Tris(pH8.8)下层胶buffer      2.5ml

10% SDS                        100 ul

10% AP(过硫酸胺)                100 ul

TEMED                         5 ul

l  混匀以上胶液,灌入胶模中,然后用ddH2O封住液接通,让胶自然凝固。

l  5%浓缩胶 5ml:

ddH2O                          2.92ml

30%丙烯酰胺                    0.8ml

1.5M Tris(pH6.8)下层胶buffer      1.25ml

10% SDS                        50 ul

10% AP(过硫酸胺)                50 ul

TEMED                         8 ul

l  待分离胶完全凝固后(约20分钟),用滤纸吸干残液,然后灌入浓缩胶并插入样品梳,待胶自然凝固。

l  将胶模装入电泳槽中,加适量的电泳buffer,拔出样品梳,清理好样品孔,依次加样,Marker510ul,样品每孔上样5080ug

l  插好电极,打开电泳仪电源,以80V电压进行电泳,待样品进入分离胶后将电压调至100V,电泳至溴酚兰到胶的边缘。

3.        转膜准备及转膜

l  1×transfer buffer        500ml  pH 8.3

        Methanol                100ml

        10×blotting buffer        50ml

        ddH2O                  347.5ml

        10% SDS                2.5ml

l  1×TTBS: 500ml

10×TBS                50ml

ddH2O                  450 ml

Tween 20                500 ul

l  小心剥离电泳胶,量好大小,算面积,立即将胶放入盛有1×transfer buffer的大平皿中。

l  剪取与胶大小一致的PVDF膜一张,两叠厚滤纸,每叠各3

l  处理PVDF膜及滤纸:甲醇2 minddH2O 3min1×transfer buffer 10min,同时将滤纸置于1×transfer buffer中。

l  组装转移塔层单元:以半干转膜仪的组装顺序为例(自下而上)

span style='mso-ignore:vglayout;;z-index:251660288;left:0px; margin-left:188px;margin-top:6px;width:92px;height:9px'           正极碳板                     

span style='mso-ignore:vglayout;;z-index:251659264;left:0px; margin-left:190px;margin-top:8px;width:88px;height:4px'           3层滤纸                       

span style='mso-ignore:vglayout;;z-index:251658240;left:0px; margin-left:191px;margin-top:9px;width:86px;height:2px'           PVDF                      

span style='mso-ignore:vglayout;;z-index:251657216;left:0px; margin-left:191px;margin-top:9px;width:86px;height:3px'           电泳胶                       

span style='mso-ignore:vglayout;;z-index:251656192;left:0px; margin-left:190px;margin-top:8px;width:88px;height:4px'           3层滤纸                    

span style='mso-ignore:vglayout;;z-index:251655168;left:0px; margin-left:188px;margin-top:6px;width:92px;height:9px'           负极碳板                     

l  电转:当盖上正极碳板后,接通电源,按0.8~1.0mA/cm2恒流转膜1小时。

4.        免疫检测

l  洗膜:电转结束,取下PVDF膜,作好标记,记住蛋白转移到膜的哪一面,将膜放到1×TBS-T中清洗,10分钟×2次。

l  倒掉TBS-T加入用1×TBS-T配制的5%脱脂奶粉封闭2小时。

l  加一抗:一抗按1500(各种抗体的最佳一抗浓度不大相同)溶于10ml5%脱脂奶粉的1×TBS-T,放在摇床中,摇4摇过夜。

l  洗膜:取出PVDF膜,用1×TBS-T洗掉未结合的一抗,10min×3次(在摇床中振摇)。

l  加二抗:二抗按12000(各种抗体的最佳二抗浓度不大相同)溶于10ml5%脱脂奶粉的1×TBS-T,孵育1小时。

l  洗膜:取出PVDF膜,用1×TBS-T洗膜10分钟×3次(在摇床中振摇)最后用1×TBS-T洗膜15分钟,浸泡在TBS-T中。

5.        暗房暴光与显像

l  11取等量的ECL发光液(AB两液)混匀。

l  将以上已洗好的PVDF膜铺于暗盒中(下方垫上塑料薄膜),在膜上加入适量的ECL发光液并使其完全覆盖整张膜,待反应5分钟后,吸干残液。

l  暗房里剪一张与膜一样大小的X光胶片,在膜上先覆盖一层保鲜膜,然后印上X光胶片暴光。(暴光时间依荧光强度而定。)

l  将已暴光的胶片放入显影液中显影,直至出现清晰影像,然后将胶片转入清水中漂洗片刻,立即将胶片放入定影液中定影。最后清水冲洗,晾干保存,扫描。

常用Buffer

1.      10×TBS   4 保存)

 Tris        66.5g

   NaCl       4.5g

溶于500 ml去离子水中,

2. 10×blotting buffer pH 8.3 4 保存)

   Tris-base    30.3g

   Glycine     144g

   溶于800ml去离子水中,再定容到1000ml,此为配1×transfer buffer 的母液。

31×transfer buffer pH 8.3  4 保存)

   Methanol               200ml

   10×blotting buffer       100ml

   ddH2O                 700ml

   10% SDS               5ml

4. 细胞(蛋白)裂解液:

l  0.05mol/L Tris-Cl(pH 8.0)(50mmol/L)

l  150mmol/L NaCl

l  2%NP-40

l  0.1%SDS

l  0.5%去氧胆酸

l  Spermin  20mM (蛋白酶抑制剂)

l  PMSF     0.1ug/mL(用前临时加)


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