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RT-PCR and Real-time PCR试验流程

具体实验流程(以细胞为例):

RNA提取用Trizol

1用预冷的无菌PBS洗细胞3次,尽可能吸尽PBS,每培养瓶加入1ml Trizol。用枪吹打细胞,然后装入预冷的EP管中,室温放置5分钟。

2.以0.2ml/ml Trizol的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒,待充分乳化溶液呈乳白状,室温放置23分钟。

3412000xg离心15min。离心后溶液分为三层,由下至上为:淡粉的酚仿层、中间白色蛋白层和澄清的水相,RNA在水相中,约为500µl

4.取上层水相于一新的离心管,按0.5ml /ml Trizol的比例加入异丙醇,室温放置20分钟。

5412000g离心10分钟。RNA沉淀后呈胶状片层。

6.弃上清,按1ml /ml Trizol液加入75%乙醇(DEPC水配制)。

7.轻轻上下翻转,4 7500xg离心5分钟。

8.小心弃上清,室温干燥35分钟。

9.将RNA溶于30-50ul(根据RNA的量而定)DEPC水中。

10RNA样品长期保存于-80冰箱。

二.RNA反转录成cDNA(以Promega M-MLV反转录酶为例):

RNA                         3µl

Oligo(dT)                     1µl

dd H2ODEPC处理)         9.5µl

以上首先70孵育5分钟,然后迅速放在冰上。

5XBuffer                     5µl

dNTP(10mM)                 5µl

Ribonuclease inhibitor          0.5µl

M-MLV RT                   1µl

_____________________________________________

                                    25µl体系

以上42孵育60分钟,然后70 10分钟。

三.PCR

1RT-PCR体系:

cDNA                        2µl

引物1(10pmol/µl)           1µl

引物2(10pmol/µl)           1µl

Buffer(10X)                 2.5µl

Taq E                      0.5µl

dNTP(10mM)                 2µl

dd H2O                     16µl

_____________________________________

                                   25µl

2Real-time PCR体系:

cDNA                       2µl

引物1(10pmol/µl)           1µl

引物2(10pmol/µl)           1µl

   SYBR mix                  10µl

dd H2O                     6µl

_____________________________________

                               20µl

内参β-actin和目的基因P53的扩增曲线

内参β-actin和目的基因P53的溶解曲线

内参β-actin的标准曲线拟合度


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