具体实验流程(以细胞为例):
一.总RNA提取用Trizol法
1.用预冷的无菌PBS洗细胞3次,尽可能吸尽PBS,每培养瓶加入1ml Trizol。用枪吹打细胞,然后装入预冷的EP管中,室温放置5分钟。
2.以0.2ml/ml Trizol的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒,待充分乳化溶液呈乳白状,室温放置2~3分钟。
3.
4.取上层水相于一新的离心管,按0.5ml /ml Trizol的比例加入异丙醇,室温放置20分钟。
5.
6.弃上清,按1ml /ml Trizol液加入75%乙醇(DEPC水配制)。
7.轻轻上下翻转,
8.小心弃上清,室温干燥3~5分钟。
9.将RNA溶于30-50ul(根据RNA的量而定)DEPC水中。
10.RNA样品长期保存于
二.RNA反转录成cDNA(以Promega M-MLV反转录酶为例):
RNA 3µl
Oligo(dT) 1µl
dd H2O(DEPC处理) 9.5µl
以上首先
5XBuffer 5µl
dNTP(
Ribonuclease inhibitor 0.5µl
M-MLV RT 1µl
_____________________________________________
25µl体系
以上
三.PCR
1.RT-PCR体系:
cDNA 2µl
引物1(10pmol/µl) 1µl
引物2(10pmol/µl) 1µl
Buffer(10X) 2.5µl
Taq E 0.5µl
dNTP(
dd H2O 16µl
_____________________________________
25µl
2.Real-time PCR体系:
cDNA 2µl
引物1(10pmol/µl) 1µl
引物2(10pmol/µl) 1µl
SYBR mix 10µl
dd H2O 6µl
_____________________________________
20µl
内参β-actin和目的基因P53的扩增曲线
内参β-actin和目的基因P53的溶解曲线
内参β-actin的标准曲线拟合度