具体实验流程（以细胞为例）：

一．总RNA提取用Trizol法

1．用预冷的无菌PBS洗细胞3次，尽可能吸尽PBS，每培养瓶加入1ml Trizol。用枪吹打细胞，然后装入预冷的EP管中，室温放置5分钟。

2．以0.2ml/ml Trizol的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，待充分乳化溶液呈乳白状，室温放置2～3分钟。

3．4℃12000xg离心15min。离心后溶液分为三层，由下至上为：淡粉的酚仿层、中间白色蛋白层和澄清的水相，RNA在水相中，约为500µl。

4．取上层水相于一新的离心管，按0.5ml /ml Trizol的比例加入异丙醇，室温放置20分钟。

5．4℃12000g离心10分钟。RNA沉淀后呈胶状片层。

6．弃上清，按1ml /ml Trizol液加入75%乙醇（DEPC水配制）。

7．轻轻上下翻转，4℃ 7500xg离心5分钟。

8．小心弃上清，室温干燥3～5分钟。

9．将RNA溶于30-50ul（根据RNA的量而定）DEPC水中。

10．RNA样品长期保存于-80℃冰箱。

二．RNA反转录成cDNA（以Promega M-MLV反转录酶为例）：

RNA                         3µl

Oligo(dT)                     1µl

dd H₂O（DEPC处理）         9.5µl

以上首先70℃孵育5分钟，然后迅速放在冰上。

5XBuffer                     5µl

dNTP(10mM)                 5µl

Ribonuclease inhibitor          0.5µl

M-MLV RT                   1µl

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                                    25µl体系

以上42℃孵育60分钟，然后70℃ 10分钟。

三．PCR

1．RT-PCR体系：

cDNA                        2µl

引物1(10pmol/µl)           1µl

引物2(10pmol/µl)           1µl

Buffer(10X)                 2.5µl

Taq E                      0.5µl

dNTP(10mM)                 2µl

dd H2O                     16µl

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                                   25µl

2．Real-time PCR体系：

cDNA                       2µl

引物1(10pmol/µl)           1µl

引物2(10pmol/µl)           1µl

   SYBR mix                  10µl

dd H₂O                     6µl

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                               20µl

内参β-actin和目的基因P53的扩增曲线

内参β-actin和目的基因P53的溶解曲线

内参β-actin的标准曲线拟合度