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DNA甲基化(MSP)检测试验流程

具体实验流程(以蜡块包埋的组织为例):

1.  用适合的内切酶消化大分子量的DNA(避免目的基因被切割),或者通过把DNA悬于蛋白酶k/SDS缓冲液,37孵育30分钟(降低DNA大小,利于充分变性)
    2.  
2.2ul新鲜配制的3M NaOH 18ul DNA样品中,搅拌混匀,短暂离心。
    3.  37
孵育15分钟(有资料证明也可42 20分钟)。
    4.  90
孵育2分钟(95 5分钟也可),置于冰上,短暂离心。
    5.  
208 ul 饱和的 NaHSO3,用NaOHPH5.0

6.  12ul 10mM 氢醌(55mg加水50ml氢醌),混匀并短暂离心。
7.  
200 ul矿物油,防止水分蒸发,限制氧化。
8.  55
孵育416小时(水浴)。
9.  
吸弃上层矿物油。
10.  
①加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,进行脱盐处理;

②加2ml 80%的异丙醇洗涤,离心10000rpm30秒;柱子换到新1.5mlEP管,弃注射器;

③加50ul预热ddH2O6070℃)放23分钟;离心(柱子与离心管一起,10000rpm30秒,DNAEP管,弃柱子。
11.  
5.5ul 3M NaOH 然后 37 孵育15分钟。
12.  
短暂离心。
13.  
1ul 糖原(10mg/ml)。
14.  
33.3ul 5M 醋酸铵PH 7.0
15.  
330ul 冷(-20℃)100%乙醇,充分混匀。
16.  -20
℃过夜(或者-70 30分钟)。
17.  4
14000 rpm 离心15分钟。
18.  
弃上清,加70%乙醇洗涤,4 14000 rpm 离心15分钟。
19.  
重悬DNA10ul 水中,室温下静置2小时,间隔旋涡振荡。
20.  
hotstart 酶做PCR,或者做Real-time PCR 


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