1.石蜡及冰冻切片的制备

标本收集

对于石蜡包埋的组织，活检或手术切除标本尽快取材或固定，避免组织自溶及抗原变性等影响免疫组化结果。对于冰冻切片的组织，取材后应立即放如液氮冷冻，然后放入-80℃保存。取材时应保持所检标本原有的结构、形态，为避免挤压组织，尽量使用锋利刀片，并且避开坏死组织。

石蜡切片

    连续切片按序贴在玻片的下1/3处。52－60℃烤片18h。切片厚3～8μm为宜，切片可在4℃保存数年（石蜡切片）

冰冻切片

    将组织取材后，置于冰冻切片机切片架上放置一段时间，待组织块冷冻变硬后切片，厚度为2～10μm。将切片贴附在载玻片上，空气中稍风干(1～2min)，后放入固定液中固定。

2.操作流程：

SABC法

⑴固定（对于石蜡包埋的组织，一般用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻组织，一般采用冰冻丙酮，但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液，应根据具体情况而定）；
     ⑵脱水浸蜡（75％乙醇90～120min，85％乙醇30～60min，95％乙醇Ⅰ1h，95％乙醇Ⅱ 2h，，无水乙醇Ⅰ45～60min，无水乙醇Ⅱ45～60min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ60min，石蜡Ⅱ60min）；

⑶包埋（铁板架包埋或其他容器）

⑷脱蜡（二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，二甲苯 Ⅲ 10min，无水乙醇5min，95％乙醇5min，85％乙醇3min，75％乙醇3min，流水冲洗。）
    ⑸PBS洗2～3次各5分钟；
    ⑹3%H₂O₂（80%甲醇）滴加在玻片组织上，室温静置10分钟；
    ⑺PBS洗5分钟×2～3次；
   ⑻抗原修复（一般情况下可采用微波修复或高压修复，对于石蜡切片的免疫组化实验时，最好采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度，不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书）；
    ⑼PBS洗5分钟×2～3次；
    ⑽滴加正常山羊血清封闭液,室温20～30分钟，甩去多余液体，不洗。
   ⑾滴加Ⅰ抗，室温静置2小时（或4℃过夜或37℃1小时）。
   ⑿PBS洗5分钟×3次；
   ⒀滴加Ⅱ抗（II抗中可加入0.05%的tween-20），20℃～37℃ 1小时；

⒁PBS洗5分钟×2～3次；               
    ⒂DAB显色5～10分钟（具体时间可通过显微镜观察确定）；
   ⒃PBS或自来水冲洗10分钟，终止显色；
    ⒄苏木精复染30s～120s分钟，盐酸酒精分化（时间极短）；
   ⒅自来水冲洗10～15分钟；
    ⒆脱水透明（70%乙醇3min，80%乙醇3min，90%乙醇3min，95%乙醇3min，100%乙醇3min，二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min）。

⒇中性树胶封片，显微镜下观察结果。