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免疫组化试验流程

1.石蜡及冰冻切片的制备

标本收集

对于石蜡包埋的组织,活检或手术切除标本尽快取材或固定,避免组织自溶及抗原变性等影响免疫组化结果。对于冰冻切片的组织,取材后应立即放如液氮冷冻,然后放入-80℃保存。取材时应保持所检标本原有的结构、形态,为避免挤压组织,尽量使用锋利刀片,并且避开坏死组织。

石蜡切片

    连续切片按序贴在玻片的下1/3处。5260烤片18h。切片厚38μm为宜,切片可在4保存数年(石蜡切片)

冰冻切片

    将组织取材后,置于冰冻切片机切片架上放置一段时间,待组织块冷冻变硬后切片,厚度为210μm。将切片贴附在载玻片上,空气中稍风干(12min),后放入固定液中固定。

 

2.操作流程:

SABC

固定(对于石蜡包埋的组织,一般用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻组织,一般采用冰冻丙酮,但对于不同的组织和抗原,可选用不同的固定液,应根据具体情况而定);
     脱水浸蜡(75%乙醇90120min85%乙醇3060min95%乙醇Ⅰ1h95%乙醇Ⅱ 2h,,无水乙醇Ⅰ4560min,无水乙醇Ⅱ4560min,二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min(可视观察结果而定),石蜡Ⅰ60min,石蜡Ⅱ60min);

包埋(铁板架包埋或其他容器)

脱蜡(二甲苯Ⅰ10min,二甲苯Ⅱ10min,二甲苯 10min,无水乙醇5min95%乙醇5min85%乙醇3min75%乙醇3min,流水冲洗。)
   
 PBS23次各5分钟;
   
 3%H2O280%甲醇)滴加在玻片组织上,室温静置10分钟;
   
 PBS5分钟×23次;
 
 抗原修复(一般情况下可采用微波修复或高压修复,对于石蜡切片的免疫组化实验时,最好采用高温加热抗原修复,这将有助于暴露抗原决定簇,从而增加免疫组化染色的强度,不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书);

   
 PBS5分钟×23次;
   
 滴加正常山羊血清封闭液,室温2030分钟,甩去多余液体,不洗。
 
 滴加Ⅰ抗,室温静置2小时(或4℃过夜或371小时)。
  
 PBS5分钟×3次;
  
 滴加Ⅱ抗(II抗中可加入0.05%tween-20),2037 1小时;

PBS5分钟×23次;               
  
 DAB显色510分钟(具体时间可通过显微镜观察确定);

  
 PBS或自来水冲洗10分钟,终止显色;
   
 苏木精复染30s120s分钟,盐酸酒精分化(时间极短);
  
 自来水冲洗1015分钟;
   
 脱水透明(70%乙醇3min80%乙醇3min90%乙醇3min95%乙醇3min100%乙醇3min,二甲苯Ⅰ10min,二甲苯Ⅱ10min)。

中性树胶封片,显微镜下观察结果。


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