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植物组培抗菌剂(PPM)

植物组培抗菌剂PPM (Plant Preservative Mixture)是为商业及研究用植物组织培养实验室和植物种植者开发、生产的旗舰产品。

作用机理

它是一种广谱抗微生物剂,可以杀死细菌和真菌细胞,防止真菌孢子的萌发,并在较高浓度下能消除内源性污染的外植体。研究表明PPM活性成分可以渗透过真菌或细菌细胞壁,抑制柠檬酸循环和电子传递链等中心代谢循环中的关键酶的活性,并且可以抑制培养基中的单糖和氨基酸向真菌和细菌细胞的运输。PPM能有效地抑制植物细胞和植物组织培养中的通过空气、水、人传播的微生物污染及内源性污染,而不会影响体外种子发芽、愈伤组织增殖和愈伤组织的再生。

优点(与抗生素相比):

★是一广谱、高效抗细菌/抗真菌剂。

★ 具有热稳定性,可以和培养基一起灭菌。

★靶标多样性,能抑制多种酶,产生抗耐药性突变体机率极低。

★可以作为植物组织培养基的标准成分,并可作为常规使用。

操作流程(注意:以下所述的操作流程是通用的,根据您的具体物种可能需要稍微改动。)

PPM简化地组织培养工作流程如下:

1、含有PPM的培养基可以在超净台外面分装,即无需无菌操作,等琼脂凝固后把盖子盖好。如果是自动分装培养基装置,我们建议在分装前后先用高压灭菌热水处理分装管。

2、如果储存在灭菌的容器中或在此之前储备液没有污染,含有PPM的热敏感或热稳定的液体培养基无需经微孔滤膜或高压灭菌。含有200mg/L或更多氨基酸或蛋白质丰富培养基,建议加入PPM后一起滤灭。

3、超净工作台里的器具(镊子或解剖刀)无需在火焰上烧,只要定期地在70%酒精里蘸一下即可。超净工作台无需验证,可以在超净工作台外面的干净台面上操作,不超过一小时即可。

4、PPM是酸性的溶液(pH 3.8)。应4度保存。低接种密度下推荐剂量0.05-0.2%(v/v)(0.5-2.0 ml PPM/L培养基)在灭菌前或灭菌后加入培养基防止通过空气传播的污染或内源性污染。处理内源性污染或获得无农杆菌的植物材料需要高剂量的PPM。

5、对于高密度的细菌或种子表皮的真菌孢子,PPM的灭菌效率不是太高。对于体外萌发,种子应该按照传统的方法先用漂白剂进行表面消毒。因此,在含有PPM的萌发培养基里,在一个非灭菌的容器中种子可以在自来水下冲洗然后在超净台中吹干。如果所使用的器具末端接触到活性细菌、真菌组织或其它怀疑被污染的东西,这些器具应该通过高压或电子加热设备进行灭菌。

6、一般剂量水平。除了内源性污染,推荐剂量是0.05-0.2%。对于愈伤增殖、器官形成和胚胎形成,推荐的剂量范围是0.05-0.075%。在培养基灭菌前或灭菌后加入PPM,可防止低密度的或生长缓慢的细菌通过空气传播的污染和内源性污染。要消除高密度污染,需要增加PPM的剂量(参考下面第七段)。

7、内源性污染:

(a)对于种子:添加 2~3% PPM 在一般习惯使用的培养基里,但千万不要添加Tween 20 和pH 调整剂,轻轻地搅拌8~12 小时,之后直接拿出放入含有 PPM 的培养基里,若是草本植物换至 0.05~0.1% PPM的萌发培养基即可;而木本植物则换至 0.2% PPM 的萌发培养基。对于种皮较硬的种子(比如芦笋、羽扇豆属植物、观赏棕榈、玫瑰等)应该在用PPM灭菌前先在水中浸泡2-4个小时。

(b)对于外植体:以 1cm 长的外植体(或者更短)为例,添加4~5% PPM 到全MS基盐中 ,但不要添加 Tween 20 和 pH 调整剂,搅拌4~12 小时之后无需冲洗直接插入含有PPM 的培养基里,若是草本植物换至含0.05~0.1% PPM 的培养基即可;而木本植物则换至含 0.2% PPM 的培养基。

注意:以下从第7段(c)到10用于观赏植物,并非仅北美用户。

(c)对于块茎,球茎和鳞状物:把整个块茎/球茎/鳞状物在漂白剂里摇或搅拌。然后用水冲洗(可以在非无菌条件下操作)。把块茎/球茎切成薄片,在含有4-5% PPM的全基盐中摇或搅拌12-24 h,不要加pH调整剂和Tween 20。不用冲洗直接插入到含有0.1-0.2% PPM的培养基中。

8、如果按照以上操作流程没有得到满意的结果(尤其是厚的和非常密集的外植体,种子)我们建议以下流程:

(a)在水中摇或搅拌外植体(较软的组织 1 h, 较坚硬的组织 2 h)

(b)将外植体在含有50% PPM的全MS基盐中(不加pH调整剂和Tween 20)摇或搅拌5-10 min。

(c)无需冲洗,直接把处植体插入到培养基中。如果真菌污染,可以选择额外再加入PPM到培养基中。然而,细菌或混合污染,第一个月在培养基中加入0.05-0.2%的PPM是必要的。不要丢弃高度氧化的外植体,因为大约50%的外植体在4-6 周内即可恢复。

注意:请参考第9段下面的注意事项2和3.

9、 为了消除“组培中”污染的植物材料(抢救措施):

(注意:明显地污染不超过一周的组织)

(a)在自来水细水流下面用牙刷清洗材料。在含有50% PPM(用灭菌水稀释)中摇或搅拌5-15 min。对于细菌或混合污染,我们建议用低pH值 2.8-3.2的溶液,即100% PPM与0.6g/L的柠檬酸溶液(用灭菌水)按1:1混合。

(b)不用冲洗直接把处理好的材料插入到含有0.05-0.2% PPM的培养基里,培养至少一个月。前10天弱光培养,像上面提到的一样,不要丢弃高度氧化的外植体,等4-6周以后将有约50%的材料可恢复。

如果真菌孢子或细菌位于外植体的内部而PPM无法接触到的情况下,把材料在水中浸泡一段时间,然后沿着外植体切片,在50% PPM中摇或搅拌5-15 min。

通过以上所有消毒步骤,保证PPM能够充分接触到外植体的整个表面。

一般注意事项:

1、 用PPM消毒后首次转移的材料,我们建议把整个外植体插入半固体培养基中。

2、 50% PPM溶液能重复利用大约5-10次。重复利用的次数取决于所处理外植体的体积和接种密度。保存50% PPM在4℃以延长它的活性。如果必要,准备两种PPM消毒液:一种是灭菌内源性污染,第二种是灭菌“组培中”的污染。用第二种消毒溶液处理材料后都要用0.2 μm的滤膜滤灭,滤灭过程可以非无菌条件下完成。一个滤器能用于溶液滤灭的整个过程。

3、 如果用50% PPM处理材料效果仍不佳,可以用100% PPM。处理方法跟50% PPM相似,但处理时间不要超过10 min。

10、 消除农杆菌:

共培养之后,用水冲洗叶盘。然后把转染的叶盘在含有100% PPM的全基盐中蘸(整个叶盘)约2 min。 用两张无菌纸巾吸干后放到含有常用抗生素的培养基上。三周后,转到只含有0.05-0.075% PPM的培养基上。

结论:

PPM必将为任何一个组织培养实验室带来便利,并极大地提高技术人员和实验室的工作效率。但每个实验室的条件不同可能影响PPM的效力。


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